Jul 16, 2023
Genomische und transkriptomische Profilierung von Phönixkolonien
Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 13726 (2022) Diesen Artikel zitieren 744 Zugriffe 1 Zitate 3 Altmetrische Metrikdetails Pseudomonas aeruginosa ist ein gramnegatives Bakterium, das für verantwortlich ist
Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 13726 (2022) Diesen Artikel zitieren
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Pseudomonas aeruginosa ist ein gramnegatives Bakterium, das für zahlreiche Infektionen beim Menschen verantwortlich ist. Zuvor wurden als Reaktion auf hohe Konzentrationen von Aminoglykosiden neuartige antibiotikatolerante Varianten identifiziert, die als Phoenix-Kolonien bekannt sind, sowie Varianten, die lebensfähigen, aber nicht kultivierbaren (VBNC) Kolonien ähneln. In dieser Studie wurden die Mechanismen hinter der Entstehung von Phönixkolonien und VBNC-ähnlichen Kolonien weiter untersucht, wobei sowohl die Sequenzierung des gesamten Genoms als auch die RNA-Sequenzierung zum Einsatz kamen. Es wurde festgestellt, dass Phoenix-Kolonien einen Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP) im PA4673-Gen aufweisen, der vermutlich für ein GTP-bindendes Protein kodiert. Im Vergleich zur Gründerpopulation wurden in VBNC-ähnlichen Kolonien keine SNPs identifiziert. Die RNA-Sequenzierung konnte keine Veränderung in der Expression von PA4673 nachweisen, zeigte jedoch mehrere unterschiedlich exprimierte Gene auf, die möglicherweise eine Rolle bei der Entstehung von Phönixkolonien spielen. Eines dieser unterschiedlich exprimierten Gene, PA3626, kodiert für eine tRNA-Pseudouridin-Synthase, deren Ausschaltung zu einem völligen Fehlen von Phoenix-Kolonien führte. Obwohl nicht sofort klar ist, ob die in dieser Studie identifizierten Gene möglicherweise noch nicht erkannte Wechselwirkungen aufweisen, können sie zum Verständnis beitragen, wie Phönixkolonien in der Lage sind, bei Antibiotika-Exposition zu entstehen und zu überleben.
Pseudomonas aeruginosa ist ein gramnegatives Bakterium, das überall in der natürlichen Umwelt vorkommt. Als opportunistischer Erreger wird er am häufigsten mit Infektionen mit Mukoviszidose (CF) in Verbindung gebracht, kann aber auch in chronischen Wunden und postoperativen Wundinfektionen vorkommen1,2,3. P. aeruginosa nutzt die Bildung von Biofilmen, persistierenden Zellen und die Entwicklung von Multiresistenzmechanismen, um der Abtötung durch antimikrobielle Wirkstoffe zu entgehen4,5,6,7. Zusätzlich zu diesen antimikrobiellen Toleranz- und Resistenzmechanismen wurde festgestellt, dass sich P. aeruginosa im Rahmen einer Infektion schnell an seine Umgebung anpasst, was zu Bedenken hinsichtlich einer verringerten Wirksamkeit antimikrobieller Wirkstoffe bei der Ausrottung von P. aeruginosa führt8.
In einer früheren Studie identifizierte unser Labor einen neuartigen, Aminoglykosid-toleranten Phänotyp von P. aeruginosa, den wir Phoenix-Kolonien genannt haben. Phönixkolonien können in einer mit Antibiotika beladenen Umgebung überleben und gedeihen. Sobald Phönixkolonien jedoch aus der anfänglichen Antibiotika-Umgebung entfernt werden, kehren sie zu einem Wildtyp-Niveau der Antibiotika-Empfindlichkeit zurück9. Phoenix-Kolonien unterscheiden sich von der traditionellen Toleranz dadurch, dass sie in der Lage sind, während der gesamten Antibiotika-Exposition ein hohes Maß an Stoffwechselaktivität aufrechtzuerhalten, während die traditionelle Toleranz typischerweise das Ergebnis eines langsamen Wachstums oder einer Verringerung des Stoffwechsels ist. Darüber hinaus unterscheiden sich Phoenix-Kolonien sowohl von heteroresistenten Kolonien als auch von persistierenden Zellen. Mithilfe der Populationsanalyse-Profilierung, einer traditionellen Methode zur Identifizierung von Heteroresistenzen, wurde festgestellt, dass Phoenix-Kolonien nach der Isolierung durchweg antibiotikaempfindlich sind. Es wurde auch gemessen, dass die Tobramycin-Konzentration in der Region, in der Phönixkolonien entstehen, etwa das Zehnfache der minimalen Hemmkonzentration (MHK) beträgt, die das Wiedererwachen persistierender Zellen zum Zeitpunkt des Auftretens von Phönixkolonien verhindern würde10. In derselben Studie identifizierten wir einen zusätzlichen Phänotyp, der dem Phänotyp der lebensfähigen, aber nicht kultivierbaren Kolonien (VBNCs11) ähnelte. Diese „VBNC-ähnlichen“ Kolonien konnten jedoch in der anfänglichen Antibiotikaumgebung wachsen, konnten jedoch nicht kultiviert werden andernfalls einschließlich Kulturen, die das gleiche Antibiotikum enthalten9. Während die Bedeutung dieser Phänotypen im klinischen Umfeld derzeit nicht bekannt ist, ist es möglich, dass Phoenix-Kolonien oder VBNC-ähnliche Kolonien zu chronischen oder wiederkehrenden Infektionen führen, ähnlich wie bei persistierenden Zellen7. Darüber hinaus scheint es zwar so zu sein, dass die Phönixkolonien nur in Gegenwart von Aminoglykosiden entstehen9, die molekularen und genetischen Mechanismen, die zur Entstehung von Phönixkolonien und VBNC-ähnlicher Entstehung führen, sind jedoch unbekannt. Das Verständnis der genetischen Veränderungen in diesen Zellen oder Veränderungen der Genexpression könnte bessere Präventions- oder Behandlungsmöglichkeiten bei der Behandlung chronischer oder wiederkehrender Infektionen ermöglichen.
In dieser Studie verwendeten wir die Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS) von Phoenix-Kolonien und VBNC-ähnlichen Kolonien, um einen Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP) zu identifizieren, der möglicherweise mit der Entstehung von Phoenix-Kolonien in Gegenwart hoher Konzentrationen von Aminoglykosiden verbunden ist. Darüber hinaus wurde eine RNA-Sequenzierung an Phoenix-Kolonien sowie an VBNC-ähnlichen Kolonien durchgeführt und differentiell exprimierte Gene (DEGs) identifiziert, die für die Antibiotika-Anpassungsphänotypen verantwortlich sein könnten, die sowohl von Phoenix-Kolonien als auch von VBNC-ähnlichen Kolonien dargestellt werden.
Wie bereits gezeigt9, wurden antibiotikaresistente und tolerante Variantenkolonien kultiviert, indem ein P. aeruginosa PAO1-Biofilmrasen hohen Konzentrationen an Tobramycin ausgesetzt wurde, indem eine CaSO4-Perle mit 1 mg Tobramycin eingesetzt wurde (Abb. 1). Genomische DNA wurde aus Phoenix-Kolonien, VBNC-ähnlichen Kolonien und der Gründerpopulation von P. aeruginosa PAO1 isoliert. Die Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS) wurde mit einem Nanopore MinION Sequencer durchgeführt und die Lesevorgänge wurden dem PAO1-Referenzgenom zugeordnet. Zugeordnete Lesevorgänge wurden auf das Vorhandensein von SNPs sowie Einfügungen oder Löschungen (Indels) analysiert. Nur die Probe der Phoenix-Kolonie kodierte irgendwelche SNPs im Vergleich zum PAO1-Referenzgenom und keine Proben (Phoenix-Kolonie, VBNC-ähnliche Kolonie oder Kontrollkolonie) enthielten Indels. Die einzelne Guanin-zu-Thymin-Variante (GCF_000006765.1:c.353G>T) trat innerhalb des PA4673-Gens auf, einem hypothetischen zytosolischen Protein, das eine Aminosäureveränderung von Serin zu Isoleucin (S118I) hervorrief.
Isolierung von P. aeruginosa-Kolonievarianten zur Untersuchung des Genoms und der Genexpression. (A) Diagramm der experimentellen Methoden zur Erlangung der Entstehung einer Variantenkolonie für P. aeruginosa PAO1 mit Tobramycin. (B) Bilder des In-vitro-Bildgebungssystems (IVIS) repräsentativer Phoenix-Kolonieplatten zeigen Bereiche mit Bakterienproben. 72 Stunden nach der Platzierung der Tobramycinkügelchen wurden Proben vom Rand der Clearance-Zone (ZOC) entnommen, wo am nächsten Tag nach fortgesetzter Inkubation Phönixkolonien entstehen würden. Sechsundneunzig Stunden nach der Platzierung der Tobramycinkügelchen wurden Proben von Phoenix-Kolonien, VBNC-ähnlichen Kolonien und dem äußeren Hintergrundrasen entnommen. Zusätzlich wurden Proben von Bakterienrasen entnommen, die 72 Stunden lang gewachsen waren und keinen Antibiotika ausgesetzt waren, um sie als Vergleichskontrollen zu verwenden. Rot weist auf eine hohe Stoffwechselaktivität hin, Blau auf eine geringe Stoffwechselaktivität und Schwarz auf keine Stoffwechselaktivität.
Um den Einfluss des S118I-Polymorphismus in PA4673 zu bestimmen, wurde eine De-novo-Proteinmodellierung mit Phyre212 durchgeführt. Die Strukturmodelle sowohl der Wildtyp- als auch der mutierten Proteine zeigen eine Veränderung in der Sekundärstruktur des mutierten Proteins, insbesondere die Bildung eines vorhergesagten β-Faltblatts an der Mutationsstelle, das sich auf einer exponierten Seite des Proteins befindet Es wird auch eine veränderte Hydrophobie in der mutierten Region vorhergesagt (Abb. 2). Diese Modifikation kann zu einer Veränderung einer Bindungsstelle oder Proteinfunktion führen. Die Identifizierung funktioneller Domänen in beiden PA4673-Isoformen ließ Domänen zwischen AA001 und AA363 vorhersehen, was darauf hindeutet, dass sie wahrscheinlich als GTP-bindende Proteine fungieren, da sie mit 100-prozentiger Sicherheit mit dem YchF-GTP-bindenden Protein von Schizosaccharomyces pombe übereinstimmen13,14. Zusätzlich wurde die Transposonmutante PA4673 aus der Transposonmutantenbibliothek P. aeruginosa von Colin Manoil15 auf das Entstehen einer Phoenix-Kolonie untersucht. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen Wildtyp P. aeruginosa PAO1 und der PA4673-Transposonmutante beobachtet (p = 0,71).
Proteinstruktur von Wildtyp und mutiertem PA4673. Proteinstrukturen wurden mithilfe von Phyre2 aus den Aminosäuresequenzen von Wildtyp und mutiertem PA4673 abgeleitet. Das rote Kästchen zeigt den durch den SNP verursachten Strukturwandel. Die Identifizierung funktioneller Domänen in beiden PA4673-Isoformen weist darauf hin, dass sie wahrscheinlich als GTP-bindende Proteine fungieren. Da das SNP eine Aminosäureveränderung im äußeren Teil der vorhergesagten Proteinstruktur verursacht, kann es zu einer Veränderung einer Bindungsstelle oder Proteinfunktion kommen.
Aufgrund des Mangels an eindeutigen genetischen Kandidaten zur Förderung alternativer Koloniestaaten wurde ein transkriptomischer Ansatz verwendet, um Genregulationsänderungen zu definieren, die mit jedem alternativen Kolonietyp verbunden sind. RNA wurde aus Proben am Rand des ZOC nach 72 Stunden, aus mehreren Koloniepopulationen nach 96 Stunden (Phoenix-Kolonien, VBNC-ähnliche Kolonien und der äußere Hintergrundrasen) und aus einem 72 Stunden lang unbelichteten Rasen als Kontrolle isoliert vorbereitet für die Illumina-basierte Sequenzierung (Abb. 1). Obwohl Phoenix-Kolonien 96 Stunden nach der Antibiotika-Exposition isoliert wurden, wuchsen sie erst seit etwa 24 Stunden als eigenständige Kolonien innerhalb des ZOC und waren immer noch metabolisch aktiv (Abb. 1), was darauf hindeutet, dass sie immer noch aktiv Methoden anwendeten, um die Antibiotika-Exposition zu überleben .
Die unterschiedliche Genexpression von Phoenix-Kolonien oder VBNC-ähnlichen Kolonien wurde durchgeführt, um Transkriptionsprofile zu definieren, die jeden Phänotyp unterscheiden. Zunächst wurde unter Verwendung der Expression aller Gene ein mehrdimensionales Skalierungsdiagramm (MDS) erstellt, um die Beziehungen zwischen allen Proben zu untersuchen (Abb. 3). Dieses Diagramm zeigt eine kompakte Häufung unter biologischen Replikaten jedes Koloniephänotyps mit Ausnahme der 96-Stunden-Außenrandpopulationen, während die Randproben der ZOC-Gruppe, der Kontrolle und des äußeren Hintergrundrasens für sich allein gehäuft waren. Die Phoenix-Kolonien und VBNC-ähnlichen Kolonien überlappen stark, was auf sehr ähnliche transkriptomische Profile hinweist. Die unterschiedliche Genexpression zwischen den Kontrollrasen- und Phoenix-Kolonien sowie den Kontrollrasen- und VBNC-ähnlichen Kolonien identifizierte 63 bzw. 90 Gene mit signifikant unterschiedlicher Transkripthäufigkeit (> 2-fache Änderung, korrigierter p-Wert < 0,05, Abb. 4). Diese Gene wurden beim Vergleich von Phoenix-Kolonien mit dem Kontrollrasen in 40 herunterregulierte und 23 hochregulierte Gene aufgeteilt, und bei VBNC-ähnlichen Kolonien im Vergleich zur Kontrolle waren es 56 herunterregulierte und 34 hochregulierte Gene (Tabellen 1, 2). . Es gab keine signifikante unterschiedliche Expression von PA4673, dem Gen, das den SNP der Phoenix-Kolonie enthält. Die DEGs wurden zur DAVID-, KEGG- und Gen-Ontologie-Analyse eingereicht, es wurde jedoch keine signifikante Korrelation festgestellt.
Mehrdimensionales Skalierungsdiagramm (MDS), das die Häufung von Isolaten zeigt. Für jede Isolatprobe wurde ein MDS-Diagramm unter Verwendung biologischer Variationskoeffizienten (BCV) aus Transkriptzählungen erstellt. Abgesehen von den Edge-Proben gruppieren sich die Proben aus jeder Gruppe gut zusammen, und die Phoenix-Kolonien und VBNC-ähnlichen Kolonien überschneiden sich erheblich. Kontrollrasen-, Kanten- und Außenproben gruppieren sich eigenständig und getrennt von den Phoenix- und VBNC-ähnlichen Proben.
Vulkandiagramme von DEGs. (A) Der Vergleich der Transkriptzahlen der Phoenix-Kolonie mit den Transkriptzahlen der Kontrollrasen zeigte 63 Grad. (B) Der Vergleich der Transkriptzahlen der VBNC-ähnlichen Kolonien mit den Transkriptzahlen der Kontrollrasen zeigte 90 Grad. (A, B) Rote Punkte zeigen Gentranskripte an, die deutlich hochreguliert waren (mehr als das Zweifache und korrigierter p-Wert von 0,05 oder weniger). Blaue Punkte zeigen Gentranskripte an, die deutlich herunterreguliert wurden (mehr als das Doppelte und korrigierter p-Wert von 0,05 oder weniger). Schwarze Punkte zeigen Gene ohne signifikanten Unterschied in der Transkription an.
Transposon-Mutanten aus der Transposon-Mutantenbibliothek Colin Manoil15 P. aeruginosa für jedes DEG wurden auf Veränderungen in der Häufigkeit der Entstehung von Phönixkolonien untersucht. Für neun DEGs stand in der Bibliothek kein entsprechender Transposonmutant für das Screening zur Verfügung (Tabelle 1). Aufgrund der umfassenden Natur der Manoil-Transposon-Bibliothek sind diese neun Gene wahrscheinlich essentiell. Der Transposon-Mutant für PA3626 führte jedoch zu einem völligen Fehlen der Entstehung von Phönixkolonien, wenn er Tobramycin ausgesetzt wurde (n = 6). PA3626 kodiert für die Pseudouridin-Synthase D (TruD)16. Die Komplementierung des vollständigen PA3626-Gens in die PA3626-Transposonmutante unter Verwendung eines pUCP18:PA3626-Plasmids stellte die Häufigkeit der Bildung von Phoenix-Kolonie auf das Wildtyp-Niveau wieder her (Abb. 5), was auf die Bedeutung von TruD für die Entstehung von Phoenix-Kolonie hinweist.
Die Komplementierung von PA3626 zeigt die Rettung des Phoenix-Phänotyps. Phoenix-Koloniezahlen wurden für Wildtyp-P. aeruginosa PAO1, die PA3626-Transposonmutante und den PA3626-Komplementationsstamm ermittelt. Nach der Komplementierung der Transposon-Mutante kehrten die Zahlen der Phoenix-Kolonie auf das Wildtyp-Niveau zurück, was die Bedeutung der tRNA-Pseudouridin-Synthase D für die Entstehung von Phoenix-Kolonien weiter bestätigt. *p < 0,05, **p < 0,01, n = 3.
Da Phoenix-Kolonien offenbar nur in Gegenwart von Aminoglykosiden9 entstehen, wurden zusätzliche Tests mit Tetracyclin, einem Inhibitor der tRNA-Bindung an die P-Stelle des Ribosoms, und Chloramphenicol, einem Inhibitor der Peptidverlängerung, durchgeführt. Weder Tetracyclin noch Chloramphenicol zeigten die Entstehung von Phönixkolonien innerhalb des ZOC, was ein weiterer Hinweis darauf ist, dass Phönixkolonien ein Aminoglykosid-spezifisches Phänomen sind.
Pseudomonas aeruginosa ist ein wichtiger bakterieller Krankheitserreger, der sowohl an oberflächlichen als auch an lebensbedrohlichen Infektionen beteiligt ist und leicht Toleranz und Resistenz gegenüber mehreren antibakteriellen Arzneimitteln entwickelt hat. In dieser Studie wurden sowohl die Genome als auch die Transkriptome sowohl von Phoenix-Kolonien als auch von VBNC-ähnlichen Kolonien untersucht. Zur Identifizierung konservierter Treibermutationen wurde die Sequenzierung des gesamten Genoms mit Pooling der Proben verwendet. Während VBNC-ähnliche Isolate einen anderen Phänotyp als Wildtyp-P. aeruginosa aufweisen, waren beide Phänotypen genotypisch identisch. Im Vergleich zum Wildtyp von P. aeruginosa weisen Phoenix-Kolonien jedoch einen SNP im PA4673-Gen auf, der voraussichtlich ein GTP-bindendes Protein kodiert, das YchF in S. pombe ähnelt13,14. Dieses SNP führt zu einer Veränderung der Proteinstruktur in einer externen Region des Gens und könnte möglicherweise zu einer Veränderung einer Bindungsstelle führen. GTP-bindende Proteine, auch G-Proteine genannt, sind molekulare Schalter, die GTP zu GDP hydrolysieren und an die Membran gebunden sind, um die Stimulierung nachgeschalteter Effekte durch extrazelluläre Reize zu ermöglichen17. Eine Veränderung der Fähigkeit eines G-Proteins, an ein Substrat zu binden, kann einen großen Einfluss auf nachgeschaltete Effektoren innerhalb des Signalwegs haben und es Phoenix-Kolonien ermöglichen, das Vorhandensein hoher Antibiotikakonzentrationen vorübergehend zu tolerieren.
Transkriptionell wurde festgestellt, dass sich sowohl Phoenix-Kolonien als auch VBNC-ähnliche Kolonien getrennt von Zellen im Biofilm des Kontrollrasens, die keinen Antibiotika ausgesetzt waren, dem Rand des ZOC und den äußeren Hintergrundrasenkontrollen gruppierten und dabei gut miteinander gruppierten. Es ist interessant, dass sowohl die Phoenix-Kolonien als auch die VBNC-ähnlichen Kolonien einander transkriptomisch ähnlich sind, obwohl sie als zwei unterschiedliche Phänotypen erscheinen. Es ist möglich, dass VBNC-ähnliche Kolonien eine Untergruppe von Phoenix-Kolonien sind, denen die Fähigkeit zur Kultivierung fehlt, da sie von einem Metaboliten in der ursprünglichen Umgebung entweder des ursprünglichen Biofilmrasens oder umgebender Variantenkolonien abhängig sind. Es ist auch interessant festzustellen, dass in Phoenix-Kolonien oder VBNC-ähnlichen Kolonien keine signifikanten Veränderungen des Stoffwechselwegs festgestellt wurden, die für die Antibiotikatoleranz dieser Phänotypen verantwortlich sein könnten. Dies steht im Gegensatz zu den typischen Toleranzphänotypen von P. aeruginosa, einschließlich persistierender Zellen, kleiner Kolonievarianten und adaptiver Resistenzkolonien, die in einen Ruhezustand übergehen, Wachstumsdefekte aufweisen oder auf andere Weise metabolisch gesteuert werden10,18,19,20,21,22 .
Bei der weiteren Untersuchung der mit Phönixkolonien assoziierten DEGs wurde ein Gen gefunden, das beim Screening keine Entstehung von Phönixkolonien aufwies: PA3626, das für die tRNA-Pseudouridinsynthase D (TruD) kodiert. Tobramycin, das Antibiotikum, das mit der Entstehung von Phönixkolonien in Verbindung gebracht wird9, ist ein Aminoglykosid. Aminoglykoside binden irreversibel an den 30S-Teil des bakteriellen Ribosoms, was aufgrund einer sterischen Hinderung während der Translation zu einer Fehlbindung der tRNA an die mRNA führt23. Eine Antibiotikaresistenz gegenüber Aminoglykosiden kann durch Modifikation der ribosomalen Zielstelle24 verliehen werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Aminoglykoside auch direkt mit tRNA interagieren und zu einem Verlust der Interaktion zwischen den T- und D-Loops sowie zur Entfaltung des D-Stamms führen können25,26. TruD wandelt Uracil-13 im D-Loop in Pseudouridin um, was die Art und Weise beeinflussen kann, wie Aminoglykoside mit der tRNA interagieren können27. Das Ausschalten von TruD durch Transposon-Mutagenese führte zu einer Eliminierung der Entstehung von Phoenix-Kolonie, die durch Plasmidkomplementierung auf Wildtyp-Niveau wiederhergestellt werden konnte. Dieser Befund ist interessant, da er uns vermuten lässt, dass Tobramycin zusätzlich zum Ribosom möglicherweise auch mit der tRNA interagiert, was zum Zelltod führt. Phoenix-Kolonien modifizieren dann möglicherweise ihre tRNA mit TruD, um die tRNA-Stabilität zu erhöhen und ein Überleben bei Tobramycin-Exposition zu ermöglichen, obwohl dies zur Bestätigung noch weiterverfolgt werden muss. Darüber hinaus besteht ein Konflikt zwischen den PA3626-Expressionsniveaus (herunterreguliert) und den PA3626-Knockout-Daten, was darauf hindeutet, dass PA3626 für die Entstehung von Phönixkolonien notwendig ist. Weitere Forschung und Verständnis von PA3626 und seinen Zielstellen könnten dazu beitragen, diese widersprüchlichen Ergebnisse zu klären und Einblicke in die beteiligten Mechanismen zu gewinnen.
Weitere Forschung, einschließlich epigenetischer Erforschung, ist erforderlich, um zu einem vollständigen Verständnis sowohl der Phönixkolonien als auch der VBNC-ähnlichen Kolonien zu gelangen. Wenn wir verstehen, wie diese und andere bakterielle Phänotypen in Gegenwart von Antibiotika überleben können, sind wir besser darauf vorbereitet, die Zunahme antibiotikatoleranter und -resistenter Infektionen zu kontrollieren.
Für den bildgebenden Teil dieser Studie wurde der biolumineszierende Stamm P. aeruginosa Xen41 (Xenogen Corp., USA) verwendet (Abb. 1). P. aeruginosa Xen41 enthält ein metabolisch gesteuertes Lux-Operon, das eine Visualisierung mit IVIS ermöglicht und den Grad der Stoffwechselaktivität des Bakterienrasens und der Kolonien anzeigt, da eine Zunahme der Lumineszenz mit einer Zunahme der Stoffwechselaktivität der Bakterien korreliert. In dieser Studie wurde auch P. aeruginosa PAO115, der Elternstamm von P. aeruginosa Xen41, verwendet. Stammkulturplatten wurden durch Ausstreichen von Glycerin-Stammkulturen, die bei –80 °C gelagert wurden, auf frische Luria-Bertani (LB)-Agarplatten hergestellt. Bestrichene Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Einzelne Kolonien wurden isoliert und in 20 ml LB-Brühe überführt. Brühenkulturen wurden über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 37 °C und 200 U/min inkubiert.
Es wurden 240 mg Tobramycin (Sigma-Aldrich) pro 20 g CaSO4-Halbhydrat (Sigma-Aldrich) verwendet28. Nach dem Mischen der beiden Pulver wurde steriles Wasser zugemischt, um eine dicke Paste herzustellen. Die Paste wurde in Silikonformen (Biocomposites Ltd.) ausgebreitet, um halbkugelförmige Perlen mit einem Durchmesser von 4,5 mm zu bilden. Die Perlen wurden über Nacht bei Raumtemperatur trocknen gelassen, bevor sie aus der Form genommen und bei 4 °C gelagert wurden. Zusätzlich wurden Perlen hergestellt, die Tetracyclin (960 mg/20 g CaSO4) und Chloramphenicol (3,8 g/20 g CaSO4) enthielten.
Phoenix-Kolonien wurden gemäß Sindeldecker et al.9 erhalten. Kurz gesagt, eine Übernachtkultur von P. aeruginosa PAO1 wurde mit steriler LB-Brühe auf eine OD600 von 0,1 verdünnt. Einhundert µl der verdünnten Kultur wurden auf LB-Agar in Polystyrolplatten mit 100 mm Durchmesser (Fisher Scientific, USA) ausgebreitet. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator (Heracell 150i, Thermo Scientific) inkubiert, um die Entwicklung eines Rasenbiofilms zu ermöglichen. Eine mit Tobramycin beladene Calciumsulfatperle wurde in die Mitte der Platte gegeben und mit einer sterilen Pinzette in den Agar gedrückt. Anschließend wurden die Platten weitere 96 Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Platten wurden täglich auf das Auftreten einer Clearance-Zone (ZOC) sowie auf innerhalb dieser Zone entstehende Kolonien überprüft. Zusätzlich wurden 72-Stunden-Rasenbiofilme auf die gleiche Weise, jedoch ohne Tobramycinkügelchen, zur Verwendung als Kontrollrasen hergestellt.
Für die Sequenzierung des gesamten Genoms wurden Phoenix-Kolonien, VBNC-ähnliche Kolonien und Wildtyp-P. aeruginosa PAO1-Kolonien isoliert. Kurz gesagt, es wurden wie oben beschrieben Phönix-Kolonieplatten erzeugt. Nach dem Auftauchen der Variantenkolonien auf drei Replikatplatten wurden 96 Kolonien von jeder Platte in Aliquots von 100 µL PBS isoliert und bei –20 °C gelagert. Bevor die Proben bei –20 °C platziert wurden, wurden 5 µL verwendet, um 200 µL LB-Brühe mit 5 µg/ml Tobramycin in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte (Corning, Sigma-Aldrich) anzuimpfen. Weitere 5 µL wurden in eine entsprechende Vertiefung mit 200 µL LB-Brühe gegeben. Die Platten wurden 96 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Trübung in den Vertiefungen visuell verglichen. Varianten, die ein mangelndes Wachstum in der LB-Brühe sowie in der entsprechenden Vertiefung der LB-Brühe, die Tobramycin enthielt, zeigten, wurden als VBNC-ähnliche Kolonien definiert. Phoenix-Kolonien wurden als solche definiert, die in der LB-Brühe, die Tobramycin enthielt, ein mangelndes Wachstum zeigten, während sie nur in der LB-Brühe Wachstum zeigten. Wie oben wurde auch eine Übernacht-Brühkultur von P. aeruginosa PAO1 gezüchtet, um eine Wildtyp-Probe für die DNA-Extraktion bereitzustellen.
Isolate, die aus dem vorherigen Abschnitt wuchsen, wurden einem Kirby-Bauer-Assay unterzogen, um zu bestätigen, ob sie gegenüber Tobramycin resistent oder anfällig waren. Jedes Isolat wurde auf eine OD600 von 0,1 verdünnt. 100 µL jeder verdünnten Kultur wurden auf LB-Agarplatten verteilt. Eine sterile Filterpapierscheibe wurde in die Mitte jeder Platte gelegt und 10 µg einer Tobramycinlösung (1 mg/ml in PBS) wurden auf jede Scheibe gegeben. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Durchmesser der Hemmzone gemessen und sowohl mit WT P. aeruginosa PAO1 als auch mit den Richtlinien des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) verglichen, um festzustellen, ob sie resistent oder anfällig waren (Phoenix-Kolonien). Vier Phoenix-Kolonien und vier VBNC-ähnliche Kolonien wurden zufällig für die RNA-Extraktion ausgewählt.
Für jede der isolierten Proben wurde eine DNA-Extraktion mit dem GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich) durchgeführt. Nach der gDNA-Extraktion wurden die Proben gepoolt, um Proben von 400 ng gDNA zu erhalten und konservierte Treibermutationen zu identifizieren. Die Vorbereitung der Bibliothek und die Barcodes wurden mit dem Rapid Barcoding Kit (Nanopore) durchgeführt. Ein Nanopore MinION Sequencer wurde verwendet, um die Sequenzierung des gesamten Bakteriengenoms unter Verwendung der Standardeinstellungen abzuschließen. Nach der Sequenzierung wurde die Qualitätskontrolle mit Epi2ME (Nanopore) durchgeführt. Die Lesevorgänge wurden mit Porechop29 getrimmt und mit graphmap31 an einem Referenzgenom von P. aeruginosa PAO1 (GCF_000006765.130) ausgerichtet. Lesevorgänge wurden mit samtools32 sortiert und indiziert. Strukturvarianten wurden mithilfe von Sniffles33 und SNPs mithilfe von BCFtools34 identifiziert. SNPs wurden anhand eines Qualitätsfaktors > 20 ausgewählt.
Nach der Vorbereitung der Phoenix-Kolonieplatten wurden Proben zur Verwendung bei der RNA-Sequenzierung entnommen. Zweiundsiebzig Stunden nach der Platzierung der Tobramycin-Kügelchen wurden dreifache Proben vom Rasen am Rande des ZOC entnommen, wo am folgenden Tag Variantenkolonien, einschließlich Phoenix-Kolonien, VBNC-ähnliche Kolonien und resistente Kolonien, sichtbar waren. Die Randproben enthielten wahrscheinlich Vorläufer der Variantenkolonien, WT-Zellen sowie tote und sterbende Zellen. Sechsundneunzig Stunden nach der Platzierung der Tobramycinkügelchen wurden dreifache Proben vom äußeren Hintergrundrasen entnommen und Variantenkolonien, die im ZOC entstanden waren, zur Phänotypcharakterisierung isoliert (Phönixkolonien, VBNC-ähnliche Kolonien oder resistente Mutanten). Zusätzlich wurden dreifache Proben von Bakterienrasen entnommen, die 72 Stunden lang gewachsen waren und keinen Antibiotika ausgesetzt waren. Alle Proben wurden in 100 µl RNAlater (Ambion) gegeben und bei –20 °C gelagert, um die RNA vor Abbau zu schützen. Für Varianten-Kolonie-Isolate wurde eine 5-µL-Probe entnommen und zur Beimpfung von 15 ml steriler LB-Brühe verwendet und über Nacht bei 37 °C und 200 U/min unter Schütteln inkubiert. Kulturen, die nicht wuchsen, wurden als VBNC-ähnliche Kolonien betrachtet. Kulturen, die tatsächlich wuchsen, wurden weiter untersucht, um den Grad ihrer Anfälligkeit gegenüber Tobramycin zu bestimmen.
Für jede Probe wurde eine RNA-Extraktion mit dem Direct-zol RNA Miniprep Kit (Zymo) durchgeführt, einschließlich einer DNaseI-Behandlung zur DNA-Entfernung. Die RNA-Menge wurde mit Qubit 3.0 gemessen. Zur Entfernung ribosomaler RNA wurde das RiboZero Bacteria Kit (Illumina) verwendet. RNAseq-Bibliotheken mit Barcodes wurden mit dem ScriptSeq™ v2 Kit (Illumina) erstellt und 38 fmol RNA wurden auf eine Endkonzentration von 1,9 nM in Resuspensionspuffer verdünnt, wobei zur Normalisierung gleiche Mengen RNA aus jeder Probe verwendet wurden. Die Proben wurden mithilfe der Paired-End-Sequenzierung (2 × 150 bp) auf einem Illumina HiSeq 4000-Gerät sequenziert. Die Sequenzierungsablesungen wurden mit Trimmomatic v0.3835 gekürzt, mit FastQC v0.11.836 qualitätskontrolliert und mit STAR v2.7.10a37 auf das Referenzgenom für P. aeruginosa PAO1 (GCF_000006765.130) abgebildet. Nach der Lesekartierung wurden die Sequenzen visualisiert, um mithilfe von IGV (v2.4.1338) eine angemessene Genomabdeckung sicherzustellen. Die Transkriptzahlen wurden mit HTseq v0.12.439 ermittelt und mithilfe des R-Pakets edgeR (v3.24.340) auf unterschiedliche Genexpression analysiert. Mehrdimensionale Skalierungsdiagramme wurden mit der plotMDS-Funktion in EdgeR erstellt. Vulkandiagramme wurden mit der Funktion ggplot2 in R41 erstellt. Gene, die sich beim Vergleich von Phoenix-Kolonie- und VBNC-ähnlichen Kolonieproben mit 72 Stunden lang unbelichteten Rasenproben als unterschiedlich exprimiert erwiesen, wurden zur Analyse an DAVID 6.842,43, KEGG44 und Gene Ontology45,46 übermittelt.
Transposon-Mutanten (erhalten aus dem Labor von Dr. Colin Manoil15), die jedem der identifizierten unterschiedlich exprimierten Gene entsprechen, wurden in dreifacher Wiederholung auf ihre Fähigkeit untersucht, Phönixkolonien auf die gleiche Weise wie oben zu produzieren. Phoenix-Kolonien wurden mittels Replika-Plattierung nach Sindeldecker et al.9 unterschieden. Kurz gesagt wurde ein steriles Baumwollsamtquadrat (150 × 150 mm) über einen PVC-Replika-Plattierungsblock drapiert und mit einem Aluminiumring an Ort und Stelle gehalten. Die Tobramycin-Perle wurde mithilfe einer sterilen Plastikschlaufe von der Platte entfernt. Die Platte wurde markiert, um eine 12-Uhr-Position anzuzeigen, und vorsichtig auf das Samtquadrat gelegt. Die Platte wurde vorsichtig angeklopft, bevor sie von der Replikatplatte entfernt wurde. Eine frische, sterile LB-Agarplatte, die 5 μg/ml Tobramycin enthielt und an der 12-Uhr-Position markiert war, wurde auf das Samtquadrat gelegt und auf die gleiche Weise angeklopft, bevor sie entfernt wurde. Eine frische, sterile LB-Agarplatte mit einer Markierung in der 12-Uhr-Position wurde auf das Samtquadrat gelegt und vor dem Entfernen festgeklopft. Replikaplatten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Koloniemuster verglichen und Kolonien, die auf der LB-Agar-Replikaplatte, aber nicht auf der LB-Agar-Replikaplatte mit Tobramycin erschienen, wurden als Phoenix-Kolonien identifiziert. Die Anzahl der Transposon-Mutanten-Phoenix-Koloniezahlen wurde ermittelt und mit den PAO1-Zählungen der Kontrollgruppe P. aeruginosa verglichen. Der Transposon-Mutant für PA3626 zeigte keine Entstehung von Phoenix-Kolonien und es wurde eine Kontrolle durchgeführt, um sicherzustellen, dass dieser Mangel an Entstehung nicht auf einen Wachstumsdefekt des Mutanten zurückzuführen war. Sowohl WT P. aeruginosa PAO1 als auch die PA3626-Transposonmutante wurden ausplattiert und 24 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurden 1 cm × 1 cm große Bereiche isoliert und eine Verdünnungsreihe erstellt, ausplattiert und 24 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Für jede Kultur wurden KBE-Zahlen ermittelt (3,0 × 108 KBE/cm2 für WT und 7,0 × 108 KBE/cm2 für die Mutante) und verglichen (p = 0,34).
Pseudomonas aeruginosa PAO1-gDNA wurde mit dem GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit extrahiert. Nach der Extraktion wurde eine PCR durchgeführt, um das PA3626-Gen unter Verwendung von Phusion Taq-Polymerase (New England Biolabs) und Vorwärts- (5'-GCGCGGATCCATGAGCGTTCTCGGCGAA) und Rückwärts-Primern (5'-GCGCTCTAGATCAGTATCGCATGGGTT) (Integrated DNA Technologies) zu amplifizieren. Nach der Amplifikation wurde das PA3626-Produkt auf einem Agarosegel laufen gelassen und mit dem GenElute™ Gel-Extraktionskit extrahiert. Ein DNA-Verdau wurde unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamHI und XbaI (New England Biolabs) für das PA3626-Produkt und das pUCP18-Plasmid durchgeführt. Die DNA-Ligation wurde unter Verwendung der T4-DNA-Ligase (Thermo Fisher) und einem Verhältnis von Insert zu Plasmid von 7:1 abgeschlossen. Nach der Ligation wurde das Plasmid in P. aeruginosa PAO1 PA3626::Tn5 elektroporiert. Kurz gesagt, 1 ml einer Übernachtkultur von PAO1 PA3626::Tn5 wurde 1 Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Das Pellet wurde dreimal in 10 %iger Saccharose in sterilem Wasser gewaschen, bevor es in 100 µL 10 %iger Saccharose resuspendiert wurde. 5 µL des ligierten Plasmids wurden hinzugefügt und die Mischung in eine 2-mm-Elektroporationsküvette überführt. Die Küvette wurde bei 25 µF, 200 Ω und 2,5 kV elektroporiert. 1 ml steriles LB wurde in die Küvette gegeben und die Kultur in ein 1,5-ml-Röhrchen überführt und 1 Stunde lang bei 37 °C und 200 U/min unter Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Kultur auf LB-Agar mit 100 µg/ml Carbenicillin ausgebreitet und über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Mit dem Qiagen Spin Miniprep Kit wurden Isolate kultiviert und Plasmide extrahiert. Plasmide wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI verdaut und ein Agarosegel laufen gelassen, um zu bestätigen, dass Banden geeigneter Größe vorhanden waren.
Der Komplementationsstamm PA3626 wurde ausplattiert und wie oben 1 mg Tobramycin ausgesetzt. Nach dem Auftauchen der Variantenkolonie wurden die Platten auf frischem LB-Agar und LB-Agar mit 5 µg/ml Tobramycin doppelt ausplattiert. Replikaplatten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten miteinander verglichen und Kolonien, die auf der Originalplatte und der Nur-LB-Replikaplatte wuchsen, aber nicht auf der Tobramycin enthaltenden Replikaplatte wuchsen, wurden als Phoenix-Kolonien gezählt.
Aminosäuresequenzen für Wildtyp-PA4673 und PA4673, die das identifizierte SNP enthalten, wurden zur Proteinstruktur- und Funktionsmodellierung an Phyre2 auf einem internen Entwicklungsserver12 unter Verwendung des intensiven Modellierungsmodus übermittelt. Modelle wurden mit RasMol47 visualisiert. Zusätzlich wurden Aminosäuresequenzen sowohl für Wildtyp als auch für mutiertes PA4673 an den ExPASy-Server übermittelt48.
Alle Experimente wurden mit einem Minimum an dreifachen technischen Wiederholungen durchgeführt. Die ANOVA-Analyse wurde in EdgeR für differentiell exprimierte Gene durchgeführt, wobei die Signifikanz auf einen q-Wert von 0,05 eingestellt wurde. Die ANOVA-Analyse wurde für alle anderen Studien mit GraphPad Prism (v8.2.1) durchgeführt, wobei ein p-Wert von 0,05 als signifikant angesehen wurde.
Die Biolumineszenzbildgebung wurde mit einem In-vitro-Bildgebungssystem (IVIS) durchgeführt. Um Bilder zu erhalten, wurden die Platten 30 Sekunden lang belichtet. Zur besseren Visualisierung wurde eine Pseudofarben-Heatmap angewendet.
Rohdaten aus der RNA-Sequenzierung sowie verarbeitete Genzahlen für jede Probe sind über den Gene Expression Omnibus, Zugang GSE199323, verfügbar. Rohsequenzierungslesungen aus der Sequenzierung des gesamten Genoms sind über das Sequence Read Archive, Zugang PRJNA820154, verfügbar.
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Diese Arbeit wurde teilweise vom Ohio State University College of Medicine und R01 NIH-GM124436 (PS), R01AI148788 (MZA), einem NSF CAREER Award 2046863 (MZA), dem American Heart Association Grant AHA 20PRE35200201 (MJD), NIH GM132254 unterstützt (JDA) und NIH GM084065-11 (JDA). Wir möchten der Genomics Shared Resource des Ohio State University Comprehensive Cancer Center für die Durchführung der RNA-Sequenzierung danken. Wir möchten uns auch bei Robert Fillinger für die technische Unterstützung bei der RNAseq-Datenanalyse bedanken. Darüber hinaus möchten wir dem Labor von Dr. Daniel Wozniak für die Bereitstellung von Stämmen aus seinen Beständen der P. aeruginosa-Transposonbibliothek von Dr. Colin Manoil danken.
Abteilung für mikrobielle Infektion und Immunität, Ohio State University, 760 BRT, 460 West, 12th Avenue, Columbus, OH, 43210, USA
Devin Sindeldecker, Matthew Anderson und Paul Stoodley
Abteilung für Mikrobiologie, Ohio State University, Columbus, OH, USA
Matthew Dunn, Aubree Zimmer, Matthew Anderson und Juan Alfonzo
Ohio State Biochemistry Program, Ohio State University, Columbus, OH, USA
Aubree Zimmer
Abteilung für Orthopädie, Ohio State University, Columbus, OH, USA
Paul Stoodley
National Centre for Advanced Tribology at Southampton (nCATS), Maschinenbau, University of Southampton, Southampton, Großbritannien
Paul Stoodley
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DS verfasste den Haupttext des Manuskripts und bereitete die Abbildungen vor. DS, MD und AZ waren für die Datenerfassung und -analyse verantwortlich. MA, JA und PS waren für die Projektverwaltung verantwortlich und stellten finanzielle Unterstützung bereit. Alle Autoren waren an der Projektkonzeption und der experimentellen Gestaltung beteiligt. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.
Korrespondenz mit Devin Sindeldecker.
Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
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Nachdrucke und Genehmigungen
Sindeldecker, D., Dunn, M., Zimmer, A. et al. Genomische und transkriptomische Profilierung von Phönixkolonien. Sci Rep 12, 13726 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18059-1
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Eingegangen: 06. Juni 2022
Angenommen: 04. August 2022
Veröffentlicht: 12. August 2022
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18059-1
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